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Tecnologie di sequenziamento next-generation (videolezioni dagli USA)

In questa lezione del corso di genomica organizzato dall’NHGRI si parla di tecnologie di sequenziamento next-generation, a partire dal 454 della Roche fino ad arrivare ai sequenziatori di terza generazione più recenti, come Ion Torrent e Oxford Nanopore.

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Pubblicato da su 8 marzo 2012 in Educational, Scienza, Tecnologia

 

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Aziende di genomica in Italia – IGA Technology Services (Udine)

L’ultimo appuntamento del 2010 con le aziende di genomica italiane ci fa conoscere la IGA Technology Services, spinoff dell’Istituto di Genomica Applicata di Udine. L’azienda ha ereditato le competenze dell’istituto friulano che da anni si occupa con successo di genomi vegetali, integrandole con tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (è stato appena installato un HiSeq 2000 della Illumina). Risponde alle domande di myGenomix la dott.ssa Federica Cattonaro (l’ultima a destra nella foto).

IGA Technology Services ha da poco compiuto un anno di vita. Come giudica la partenza della vostra azienda?
Siamo piuttosto contenti perchè il fatturato del primo anno è stato al di sopra delle nostre aspettative. Ci aspettiamo una notevole crescita del fatturato l’anno prossimo visti i notevoli investimenti che abbiamo fatto nel 2010 per l’acquisto dei macchinari. Questo anche per far fronte alle aspettative del proprietario unico, l’Istituto fondatore (IGA, Istituto di Genomica Applicata), che non avendo alcun tipo di finanziamento strutturale ma vivendo interamente su soft money conta molto sui profitti di IGA Technology Services per far fronte alle proprie spese fisse.

Quali sono precisamente i servizi che offrite, e a chi vi rivolgete?
Offriamo servizi di sequenziamento e risequenziamento sugli strumenti Illumina Genome Analyzer Iix e HiSeq2000. Con queste piattaforme tecnologiche possiamo sequenziare genomi interi o porzioni di essi, ad esempio utilizzando tecnologie di cattura di porzioni del genoma in liquido, ma anche RNA per analizzare l’intero trascrittoma di un organismo o per identificare quella particolare famiglia di RNA non codificanti come gli RNA piccoli (smallRNA) che ha importanti funzioni nella regolazione dei geni. Inoltre con questi strumenti è possibile studiare epigenomi individuali genome-wide, cioè studiare quell’insieme di alterazioni che il genoma subisce, senza che la sequenza di DNA venga modificata. Offriamo ancora servizi di sequenziamento Sanger su sequenziatori ad alta processività per un minimo numero di 48 campioni processabili per volta e altre applicazioni che ancora prevedono l’utilizzo di sequenziatori capillari quali la genotipizzazione di microsatelliti e la costruzione di mappe fisiche di genomi soprattutto di vegetali. Annesse alle applicazioni di sequenziamento e risequenziamento forniamo poi il supporto bioinformatico per aiutare il cliente nell’analisi dei dati. Cerchiamo il più possibile quindi di fornire al cliente un servizio completo dalla preparazione del campione al dato analizzato. Vogliamo arrivare ad un modello in cui il cliente che ci affida uno studio deve intervenire sempre meno nel processo di produzione ed analisi dei dati e può partire da ciò che gli forniamo direttamente a fare la ricerca biologica di suo interesse. Questo dovrebbe consentire di rendere disponibili queste tecnologie che promettono di rivoluzionare la ricerca biologica anche a persone che non sono esperte di genomica o bioinformatica. I nostri clienti sono una settantina tra laboratori universitari, istituti di ricerca, ospedali europei e extraeuropei.

Siete certificati come Service Provider Illumina per il sequenziamento. Che cosa significa?
Essere Service Provider Illumina significa aver superato un rigoroso test di certificazione eseguito da Illumina, che ha prevvisto la richiesta di analizzare una certa quantità di dati già prodotta presso di noi, verifiche scritte riguardanti la gestione della macchina, dei campioni e della pipeline bioinformatica, una corsa di sequenziamento test su loro materiale al fine di verificare che la qualità dei dati prodotti rispettasse gli standard Illumina e infine un audit on-site. Siamo al momento gli unici in Italia ad essere entrati nel ristretto circuito dei CSPro Illumina per il sequenziamento.

Con l’avvento delle nuove tecnologie di sequenziamento, che vantaggi offre il metodo Sanger tradizionale per un’azienda di servizi come la vostra? Lo utilizzate spesso?
Abbiamo ancora richieste di sequenziamento Sanger soprattutto da ospedali e qualche università. Rimarrà ancora attuale per qualche anno nella diagnostica umana, che rispetto a qualche anno fa, adesso utilizza il sequenziamento come metodo diagostico in modo più diffuso.

Che progetti avete in atto per quanto riguarda la genomica umana?
Abbiamo svolto al momento delle commesse di risequenziamento dell’esoma umano mediante tecnologie di cattura di porzioni del genoma, su pazienti affetti da malattie neurologiche e su tumori. Abbiamo poi avuto una interessante collaborazione con gli Ospedali Riuniti di Bergamo sulla cardiomiopatia ipertrofica: con loro siamo stati i primi in Italia a utilizzare un kit custom per la cattura di specifiche regioni esoniche umane implicate in questa malattia. In campo umano ci piacerebbe partecipare a qualche progetto di risequenziamento di più ampia portata, mettendoci la nostra competenza tecnica e la nostra capacità di produzione dati, adesso pari a 40 miliardi di paia di basi/giorno.

Avete recentemente acquistato un sequenziatore di nuovissima generazione, l’HiSeq 2000 della Illumina. Cosa offre alla vostra azienda il nuovo arrivato?
Da gennaio 2011 sarà finalmente attivo, l’installazione è stata portata a termine la settimana scorsa. Con questo strumento saremo in grado di offrire servizi a più basso costo rispetto a quelli offerti finora con il GAIIx. Puntiamo inoltre a ottenere commesse più grosse, in particolare progetti di sequenziamento completi e a partecipare come PMI a bandi di ricerca in ambito EU.

Avete una grande esperienza nel campo della genomica vegetale. Quali sono i vantaggi e gli svantaggi di studiare le piante, rispetto alla genomica umana e animale?
L’istituto che controlla la società, l’Istituto di Genomica Applicata (IGA) è effettivamente dedito alla ricerca nel campo delle genomica vegetale e quindi, essendo la società una emanazione commerciale di questo istituto, le competenze vengono naturalmente trasferite alla società commerciale. L’Istituto fin dalla sua nascita, avvenuta nell’aprile 2006, ha partecipato a progetti di sequenziamento de novo di genomi vegetali di portata internazionale quali vite, pesco e Citrus (agrumi) lavorando in sinergia con il centro di sequenziamento francese GenoScope e con uno dei più grandi centri di sequenziamento americani, il Joint Genome Institute in California. Potrei dire che un vantaggio rispetto allo studio delle genomica umana e in parte a quella animale, riferendomi in questo caso solo agli animali di allevamento, è quello che non c’è molta competizione da parte di grossi centri di sequenziamento americani e inglesi per cui è ancora possibile avere il privilegio di essere gli unici a fare genomica ad alto livello su determinati genomi. D’altra parte lavorare sui genomi vegetali può essere molto complesso a causa della estrema variabilità strutturale presente a livello di sequenza e della presenza di elevate quantità di sequenze ripetute e ridondanti.

Sappiamo che in questo settore l’analisi dei dati è estremamente impegnativa. Quante persone sono impiegate in laboratorio e quanti sono invece i bioinformatici della vostra azienda?
La società attualmente dispone, oltre che della mia figura, di una persona in laboratorio e di un’altra persona che svolge sia attività di laboratorio che bioinformatica. L’analisi bioinformatica è ovviamente il grosso collo di bottiglia per chi lavora con queste macchine ed anzi riteniamo che una potenziale barriera all’ampia adozione delle tecnologie NGS e quindi allo sviluppo della ricerca genomica, genetica e biologica in Italia potrebbe essere proprio l’accesso non tanto alle piattaforme di produzione dei dati quanto alle metodologie ed infrastrutture computazionali: è veloce produrre i dati ma non è altrettanto veloce analizzarli. L’azienda intende quindi fortemente espandersi in questo settore. Al momento usufruisce delle competenze informatiche presenti presso l’Istituto di Genomica Applicata sia in termini di personale (IGA dispone di cinque informatici e un sistemista) che di infrastrutture (server e capacità di calcolo) ma intende nel corso del 2011 potenziare ulteriormente con risorse proprie le capacità di analisi bioinformatiche con investimenti sia in attrezzature che in personale ed affiancare a me nel team gestionale anche una figura di business development manager.

Allo stato attuale delle nostre conoscenze sul DNA, secondo voi quanto può essere utile, per la cura della propria salute, sequenziare il proprio genoma?
Questo è un settore in cui la tecnologia al momento corre più veloce della scienza. Alla capacità di decifrare velocemente ed a bassi costi l’intero contenuto genetico di un individuo non si è ancora affiancata la capacità di comprendere a pieno il significato biologico di queste informazioni. L’analisi genetica non ci ha ancora consentito nella maggior parte dei casi di collegare la variazione a livello di sequenza con la variazione a livello fenotipico. Detto questo, speriamo che ci possano essere rapidi progressi nel campo della genetica umana tali da rendere ancora più utile di quanto non lo sia oggi ai fini della prevenzione la disponibilità delle sequenza genomica completa. In alcuni casi specifici tuttavia la piena utilità già c’è: sequenziare il genoma completo delle cellule tumorali sicuramente ci può già dare indicazioni molto importanti ed utili per la comprensione degli eventi mutazionali e molecolari alla base dei processi di oncogenesi e per la messa a punto di terapie mirate.

Ringrazio la dott.ssa Cattonaro per la sua disponibilità e invito le aziende di genomica interessate a una eventuale intervista a contattarmi all’indirizzo mail mygenomixxx@gmail.com. Come faccio sempre per le aziende che presento, vi invito a citare myGenomix qualora decideste di acquistare i servizi di IGA Techology Services: sarà uno stimolo per continuare a curare il blog con sempre maggiore impegno e dedizione.

 

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Benvenuti all’Inferno! Ecco a voi i mostri del Beijing Genomics Institute

Sapevo che il Beijing Genomics Institute (BGI) aveva acquistato 128 sequenziatori HiSeq 2000 all’inizio di quest’anno, e solo leggere la notizia mi aveva fatto una certa impressione. Figurarsi vedere per la prima volta le foto dell’enorme stanza che accoglie questi mostri tecnologici: è un’esperienza scioccante, sempre che siate un minimo appassionati della questione, ovvio.


Gli HiSeq 2000 sono sequenziatori di seconda generazione prodotti dall’azienda californiana Illumina, strumenti che già presi singolarmente potrebbero terrorizzare qualsiasi sistemista. Ciascuno di essi produce, in una sola corsa di sequenziamento, qualcosa come 200 miliardi di paia di basi di DNA: in poco più di una settimana di lavoro, quindi, questa macchina infernale può sequenziare un genoma umano con una copertura di quasi 70 volte. Ma se questi numeri vi lasciano indifferenti, allora vi dico a quanti Gigabytes corrispondono tutte queste sequenze: i file immagine generati occupano la bellezza di 32 Terabyte (un Terabyte sono circa 1000 Gb), a cui vanno aggiunti i 3-4 Terabyte di dati prodotti a partire dalle immagini iniziali. Moltiplicate questi numeri per 128, e scoprirete quale mole di lavoro dovranno sopportare i server qui sotto, quando i sequenziatori saranno a pieno regime. Io non ho il coraggio di farla, quella moltiplicazione.

Image credit: mndoci (licenza Creative Commons)

 
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Pubblicato da su 14 ottobre 2010 in Tecnologia

 

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Sequenziato il genoma del cacao: anche la Mars tra i finanziatori

Il genoma dell’albero del cacao, Theobroma cacao, è stato sequenziato. Ad annunciarlo tramite un comunicato stampa sono i principali soggetti coinvolti nel progetto, partito due anni fa: il Dipartimento dell’Agricoltura americano, l’IBM e – udite udite – l’azienda produttrice di dolciumi Mars. Proprio così, la società che vende l’omonima barretta e altre leccornie come i famosissimi M&M’s ha investito 10 milioni di dollari per riuscire a portare a termine il sequenziamento della preziosissima pianta, senza la quale non potremmo gustare quella cosa straordinaria che si chiama cioccolato.

In partenza il progetto sarebbe dovuto durare cinque anni, ma grazie all’enorme sviluppo delle tecnologie di sequenziamento i dati sono stati resi disponibili con ben tre anni di anticipo: si possono consultare a questo indirizzo, previa dichiarazione che non verranno utilizzati per brevettare i geni depositati. Quello del cacao è un genoma relativamente piccolo (420 milioni di basi) che secondo le prime analisi dovrebbe contenere circa 35000 geni; per il suo sequenziamento sono state utilizzate le tecnologie next-generation 454 e Illumina, oltre al vecchio metodo Sanger, indispensabile per chiudere tutti i “buchi” della sequenza. Il ruolo dell’IBM all’interno del progetto si è rivelato fondamentale al momento dell’assemblaggio delle sequenze prodotte: senza il supercomputer Blue Gene il risultato finale sarebbe stato raggiunto sicuramente molto più tardi.

La sequenza genomica del cacao sarà estremamente utile per i coltivatori di tutto il mondo, che potranno ora selezionare varietà più resistenti alle malattie al fine di aumentare le rese. Forse avremo anche un cioccolato più buono e nutriente, chissà. Tuttavia, lo scopo principale sarà certamente aumentare la produzione, migliorando la resistenza delle piante alla siccità e agli agenti patogeni: dieci anni fa un’epidemia fungina decimò le coltivazioni del Brasile, che allora era uno dei principali paesi produttori. Oggi il 70% del cacao è prodotto in Africa, Costa d’Avorio e Ghana soprattutto, e se si ripetesse quanto avvenuto nel Paese sudamericano dovremmo probabilmente dire addio all’amatissimo cioccolato. Grazie Mars, da oggi comprerò più spesso le tue barrette.

Fonti: Washington Post, New York Times, Cacao Genome Database, Genome Web

 
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Pubblicato da su 15 settembre 2010 in Scienza

 

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Sequenziamento del DNA- Prima generazione (metodo Sanger)

Era da un po’ di tempo che volevo parlare delle tecniche di sequenziamento del DNA, ma avevo un dubbio: meglio trattare l’argomento in un unico lunghissimo post, oppure spalmarlo su tre post più brevi, ognuno dedicato a una delle tre generazioni di sequenziamento? Ho deciso per la seconda opzione, principalmente perché io stesso quando mi imbatto in un post chilometrico tendo a non leggerlo. Così, ecco la prima parte della mia serie sul DNA sequencing: oggi tratterò la prima generazione, vale a dire il metodo Sanger.

Innanzitutto facciamo un piccolo ripasso sul DNA. Il DNA (o acido deossiribonucleico) è una molecola che ha l’aspetto di una doppia elica formata da due catene di nucleotidi. I nucleotidi sono piccole molecole costituite da un gruppo fosfato, uno zucchero (deossiribosio) e una base azotata; mentre le prime due componenti sono sempre uguali e costituiscono l’ossatura della doppia elica, le basi azotate esistono in quattro “versioni” differenti. Esse si chiamano Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T), e godono di una proprietà importante: la complementarietà. In una molecola di DNA, una A si troverà sempre davanti a una T, così come una C si troverà sempre davanti a una G: questo significa che non è necessario sequenziare entrambi i filamenti, basta avere una delle due sequenze e quella complementare si potrà ricavare facilmente.

Prima di passare alla lettura del DNA, cioè al suo sequenziamento, è necessario amplificare il frammento di DNA di interesse. Per farlo, si esegue una reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction). Questa tecnica, inventata dal geniale quanto eccentrico Kary Mullis, sfrutta un enzima normalmente presente nelle nostre cellule, la DNA polimerasi. Utilizzando un filamento come stampo e un piccolo tratto di DNA come innesco, la DNA polimerasi è in grado di sintetizzare l’altro filamento agganciando uno dietro l’altro i nucleotidi corretti. Per moltiplicare centinaia di volte il pezzo di DNA che ci interessa è sufficiente dare alla polimerasi i nucleotidi (dNTP) e gli inneschi corretti (primer), disegnati ai lati della nostra sequenza. Riscaldando la miscela, la doppia elica si apre liberando i due filamenti, che potranno così essere raggiunti dalla polimerasi quando la temperatura verrà fatta scendere. Ripetendo diverse volte questo ciclo, si ottiene l’amplificazione del frammento di DNA che ci interessa.

Ora che il nostro DNA è stato amplificato, si può iniziare a leggere la sua sequenza. La tecnica inventata da Fred Sanger prevede ancora l’utilizzo di una polimerasi, ma questa volta ai nucleotidi tradizionali se ne aggiungono delle varianti speciali chimicamente modificate: i dideossiribonucleotidi. Quando vengono aggiunti al filamento in formazione, questi nucleotidi hanno la caratteristica di bloccare la sintesi del DNA: la polimerasi non riesce più ad aggiungere altri nucleotidi, e rilascia un frammento “monco”. A questo punto bisogna fare due cose: misurare la lunghezza di questo frammento e riconoscere il dideossiribonucleotide che si era legato per ultimo. Con queste due informazioni in mano leggere la sequenza è immediato: se ho ottenuto un frammento lungo 10 nucleotidi dove l’ultimo nucleotide aggiunto è una G, io so che in 10° posizione c’è una G. Un tempo per fare questo si eseguivano sullo stesso DNA quattro reazioni separate, per ognuna delle quali si utilizzava un dideossinucleotide diverso: ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP. Al termine della reazione, si prendevano i frammenti generati da ogni reazione e li si misurava mediante un’elettroforesi su gel: in questo gel, le molecole più lunghe si muovono più lentamente e tutti i frammenti possono quindi essere separati. Al termine, si ricostruiva la sequenza. Con l’avvento dei sequenziatori automatici, si è iniziato a fare tutto in un’unica miscela di reazione, etichettando ogni base azotata con una molecola fluorescente di colore diverso; inoltre, i frammenti si separano in tubi capillari, con un lettore ottico che registra il colore emesso dal DNA al suo passaggio.

L’invenzione di questo metodo di sequenziamento ha segnato una svolta epocale nel campo della biologia molecolare e lo dimostra il fatto che Fred Sanger ricevette per questo motivo un premio Nobel nel 1980. Tuttavia, occorre molto tempo per sequenziare in questo modo lunghi tratti di DNA: per sequenziare un milardo di basi (circa un terzo del genoma umano) è necessario più di un anno di lavoro! Inoltre, è una tecnica molto costosa: si spendono 10 centesimi di dollaro ogni mille basi. Per questi motivi si è passati ora a tecnologie di sequenziamento molto più efficienti ed economiche, le cosiddette tecnologie di seconda generazione che tratterò prossimamente.

 
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Pubblicato da su 8 settembre 2010 in Educational, Tecnologia

 

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