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La chimica del sequenziamento: passato, presente e futuro

Come molti di voi sapranno, il 2011 è stato proclamato dall’ONU l’Anno Internazionale della Chimica. La chimica è la scienza centrale, quella che più di ogni altra ha la capacità di guidare il progresso scientifico, grazie alle sue innumerevoli connessioni con la biologia, la fisica, la medicina e chi più ne ha più ne metta. Ho voluto renderle omaggio anche io, scrivendo questo post che partecipa al Carnevale della Chimica coordinato per questo mese da Anna Rita Ruberto di Scientificando.

IL DNA

Il DNA (o acido deossiribonucleico) è una molecola che ha l’aspetto di una doppia elica formata da due catene di nucleotidi. I nucleotidi sono piccole molecole costituite da un gruppo fosfato, uno zucchero (deossiribosio) e una base azotata; mentre le prime due componenti sono sempre uguali e costituiscono l’ossatura della doppia elica, le basi azotate esistono in quattro “versioni” differenti. Esse si chiamano Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T), e godono di una proprietà importante: la complementarietà. In una molecola di DNA, una A si troverà sempre davanti a una T, così come una C si troverà sempre davanti a una G: questo significa che per leggere una sequenza di DNA non è necessario sequenziare entrambi i filamenti, basta avere uno dei due e quello complementare si potrà ricavare facilmente. E’ proprio sfruttando la proprietà della complementarietà che la DNA polimerasi riesce a replicare le molecole di DNA nel momento in cui è necessario, e cioè quando la cellula deve dividersi per generare due cellule figlie con identico patrimonio genetico: utilizzando un filamento come stampo e un piccolo tratto di DNA come innesco, questo enzima è in grado di sintetizzare l’altro filamento legando uno dietro l’altro i nucleotidi corretti.

IL METODO SANGER

A Frederick Sanger bastò osservare la DNA polimerasi all’opera per capire come sviluppare il primo metodo per sequenziare il DNA. L’unico ingrediente che dovette aggiungere furono dei nucleotidi particolari, chiamati dideossinucleotidi: queste molecole hanno una modifica chimica tale per cui, una volta inserite nella catena nascente di DNA, ne interrompono la sintesi. La polimerasi non riesce più ad aggiungere altri nucleotidi, e rilascia così un frammento “monco”. A questo punto bisognava fare due cose: misurare la lunghezza di questo frammento e riconoscere il dideossinucleotide che si era legato per ultimo. Con queste due informazioni in mano leggere la sequenza è immediato: se ho ottenuto un frammento lungo 10 nucleotidi dove l’ultimo nucleotide aggiunto è una G, io so che in 10° posizione c’è una G. Un tempo per fare questo si eseguivano sullo stesso DNA quattro reazioni separate, per ognuna delle quali si utilizzava un dideossinucleotide diverso: ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP. Al termine della reazione, si prendevano i frammenti generati da ogni reazione e li si misurava mediante un’elettroforesi su gel: in questo gel, le molecole più lunghe si muovono più lentamente e tutti i frammenti possono quindi essere separati. Al termine, si ricostruiva la sequenza. Con l’avvento dei sequenziatori automatici, si è iniziato a fare tutto in un’unica miscela di reazione, etichettando ogni base azotata con una molecola fluorescente di colore diverso; inoltre, i frammenti si separano in tubi capillari, con un lettore ottico che registra il colore emesso dal DNA al suo passaggio.

L’invenzione di questo metodo di sequenziamento ha segnato una svolta epocale nel campo della biologia molecolare e lo dimostra il fatto che Fred Sanger ricevette per questo motivo un premio Nobel per la Chimica nel 1980. Tuttavia, occorre molto tempo per sequenziare in questo modo lunghi tratti di DNA: per leggere un intero genoma umano sarebbero necessari più di tre anni di lavoro! Inoltre, è una tecnica molto costosa: si spendono 10 centesimi di dollaro ogni mille basi. Per questi motivi si è passati ora a tecnologie di sequenziamento molto più efficienti ed economiche, le cosiddette tecnologie di seconda generazione.

MONTAGNE DI DATI

Le nuove macchine iniziarono a popolare il mercato dal 2005 in poi, offrendo costi minori e soprattutto enormi quantità di sequenze, vere e proprie montagne di dati che per un sequenziatore Sanger erano inimmaginabili. A farsi concorrenza c’erano diverse aziende, ma a spuntarla fu Illumina/Solexa, che conquistò rapidamente il ruolo di leader nel settore del sequenziamento genomico. I suoi sequenziatori sfruttavano ancora la DNA polimerasi come nella tecnologia precedente, ma introducevano due accorgimenti tecnici che facevano la differenza. Il primo è l’immobilizzazione del DNA su un supporto fisso: le molecole da sequenziare sono infatti incollate a un vetrino tramite degli adattatori. Questo permette di leggere milioni di frammenti di DNA contemporaneamente, perché ciascuno di essi viene a trovarsi in un punto preciso e non si può confondere con gli altri. La seconda, importantissima novità sono i terminatori reversibili. Nel metodo Sanger i nucleotidi modificati bloccavano la sintesi del DNA in modo irreversibile, mentre quelli di Illumina possono essere riattivati, grazie all’azione di un enzima che taglia via la parte di molecola che blocca il lavoro della DNA polimerasi. In questo modo, è possibile monitorare in tempo reale l’aggiunta di tutti i nucleotidi su ogni frammento, fotografando le fluorescenze emesse a ogni passaggio da tutte le molecole di DNA depositate sul vetrino.

I due grandi rivali di Solexa/Illumina erano, e sono tuttora, ABI/Solid e Roche/454. Le loro tecnologie sono molto diverse, e la prima grossa differenza è che entrambe queste aziende hanno scelto di immobilizzare le molecole di DNA non su un supporto solido, ma su delle piccole sfere, a loro volta poste su un vetrino. ABI/SOLiD ha persino abbandonato la DNA polimerasi per passare a un altro enzima, la DNA ligasi, che unisce frammenti di DNA anziché sintetizzarne di nuovi. Inoltre, ha elaborato un sistema di sequenziamento che consente di leggere due volte lo stesso nucleotide, il che abbassa di molto la possibilità di commettere errori.

Roche/454, dal canto suo, non utilizza più i nucleotidi fluorescenti, ma sfrutta un prodotto di scarto della polimerasi (il pirofosfato inorganico PPi) per generare dei flash di luce ogni volta che un nucleotide nuovo viene aggiunto. Il trucco è dare il PPi in pasto a una sulfurilasi, un enzima che lo utilizza per generare una molecola di ATP; a sua volta, l’ATP viene prelevato da una luciferasi che lo usa per ossidare una luciferina e produrre un segnale luminoso. Poiché questo segnale è sempre uguale per tutti i nucleotidi, essi devono essere immessi nel sistema un tipo alla volta: prima le A, poi le C e così via.

Gli incredibili progressi tecnologici e l’utilizzo di nuove chimiche di sequenziamento hanno permesso di fare grandi scoperte scientifiche sul nostro genoma, scoperte che presto ci saranno utili per avere cure personalizzate in base al nostro profilo genetico. Il bello, però, deve ancora arrivare. E arriverà con i sequenziatori di terza generazione, che pur essendo poco più che prototipi, promettono già grandissime cose.

IL SEQUENZIAMENTO DEL FUTURO

I prossimi anni vedranno sicuramente una nuova rivoluzione nel campo del sequenziamento, ma ancora non è chiaro se a portarla saranno macchine sempre più costose e potenti o piccoli strumenti low-cost grandi come una stampante, capaci di entrare con più facilità nella pratica medica di routine.

La prima strada è quella scelta da Pacific Biosciences, che sta mettendo a punto un sequenziatore mostruoso da 700mila dollari. Il suo punto di forza è essenzialmente uno solo: la capacità di sequenziare singole molecole di DNA. Nelle tecnologie precedenti, infatti, bisognava moltiplicare i frammenti per avere gruppi di molecole tutte uguali da sequenziare: solo così il segnale fluorescente era sufficientemente potente per poter essere visualizzabile dal lettore ottico. Riuscire a leggere una singola molecola di DNA, monitorando in tempo reale l’aggiunta dei nucleotidi, significa poter usare piccole quantità di DNA e risparmiare moltissimi soldi sui reagenti.

Altre due compagnie, invece, hanno deciso di abbandonare del tutto molecole fluorescenti e costosissimi lettori ottici. Ion Torrent ha messo in vendita un sequenziatore piccolissimo, che costa un decimo di quello di Pacific Biosciences: la sua peculiarità è che registra gli inserimenti dei nucleotidi misurando le variazioni di pH durante il sequenziamento.

Oxford Nanopore, al contrario, dice di essere in grado di leggere una sequenza di DNA basandosi sui cambiamenti nel flusso di corrente che attraversa dei fori di pochi nanometri, cambiamenti che sono caratteristici dello specifico nucleotide che viene aggiunto alla catena.

Il costo per sequenziare un genoma umano è diminuito di un milione di volte in dieci anni, e forse presto taglieremo il traguardo dei mille dollari. Arriverà il giorno in cui ci presenteremo dal nostro medico di fiducia con una chiavetta USB contenente i nostri dati genetici: grazie a queste informazioni conosceremo i farmaci più efficaci per noi e lo stile di vita che ci aiuterà a restare sani più a lungo. Non sappiamo quando entreremo veramente nell’era della medicina genomica, ma quando quel momento arriverà, il merito sarà anche degli incredibili progressi fatti negli ultimi anni dalla chimica del sequenziamento, un’altra delle infinite declinazioni della scienza di tutte le scienze, la Scienza Centrale.

 
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Pubblicato da su 15 febbraio 2011 in Scienza, Tecnologia

 

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L’asta al ribasso è cominciata: DNA Vision ti sequenzia il genoma per 7500 euro

Vi avverto: nel corso del 2011 ne vedrete parecchi di annunci del genere. La caccia al genoma da mille dollari è ormai iniziata, e se il traguardo non sarà raggiunto già entro quest’anno, ci andremo comunque molto, molto vicino. L’azienda DNA Vision con sede a Charleroi, in Belgio, si vanta sul proprio sito internet di essere il primo service provider europeo a offrire il sequenziamento completo di genomi umani. E lo fa con un’offerta davvero speciale: il prezzo ammonta ad appena 7500 euro, meno di una Fiat Seicento!

Quando si leggono simili annunci, bisogna sempre andare a guardare bene i dettagli, che in questo caso non sono moltissimi ma sono sufficienti per avere un’idea del tipo di servizio offerto. Nello specifico, il sequenziamento viene effettuato con una macchina SOLiD 5500XL con una copertura di 30X: vale a dire che il genoma viene letto mediamente trenta volte. “Mediamente” – lo dice la parola stessa – non significa che ogni singola base viene letta 30 volte, ci saranno regioni più lette e altre meno rappresentate, ma il valore medio è quello e dà un’idea della qualità della sequenza genomica che si acquista. La stessa DNA Vision offre il sequenziamento del trascrittoma per 990 euro e il sequenziamento dell’esoma (cioè della porzione di genoma codificante per proteine) per 3000 euro.

 
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Pubblicato da su 1 febbraio 2011 in Business, Genetica personale, Medicina, Salute, Tecnologia

 

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Aziende di genomica in Italia – Genomnia (Milano)

A giudicare dalle visite che il blog riceve da quando ho avuto l’idea di intervistare le aziende di genomica italiane, sembrerebbe che ci sia molto interesse verso le piccole realtà imprenditoriali che coraggiosamente hanno deciso di offrire, sul nostro territorio, prodotti ad altissimo contenuto tecnologico. Oggi parliamo di un’azienda con sede a Lainate, in provincia di Milano, fondata nell’Ottobre 2008. Genomnia, per i suoi servizi, ha deciso di puntare forte su una sola tecnologia di sequenziamento, il SOLiD della Applied Biosystems. Ci spiega le ragioni alla base di questa scelta la dottoressa Anna Moles, direttore scientifico dell’azienda, che ci racconta anche le prospettive future di Genomnia e, più in generale, il suo punto di vista sulla genomica.

Tra le tre principali piattaforme di sequenziamento di seconda generazione, voi di Genomnia avete scelto SOLiD della Applied Biosystems. Cosa c’è alla base della vostra scelta? Che cosa offre in più SOLiD rispetto alle altre tecnologie?
La nostra azienda è collegata ad un gruppo più grande, abmedica, che opera nel settore dei dispositivi medici e della chirurgia robotica. Per queste ragioni il nostro mercato di riferimento “naturale” è o meglio sarà quello della diagnostica avanzata. Il SOLiD ha delle peculiarità che rendono questa piattaforma particolarmente accurata e quindi utile per, ma non solo, la scoperta e l’individuazione di mutazioni del codice genetico. Questa piattaforma infatti è l’unica ad utilizzare un sistema di sequenziamento, basato sulla ligasi, grazie al quale ogni base viene interrogata 2 volte “componendo” la sequenza in un codice colore grazie al quale è più semplice differenziare gli errori di sequenziamento dalle vere e proprie variazioni nella sequenza del DNA.

La vostra azienda offre servizi di vario genere, dal risequenziamento genomico al ChIP sequencing. Qual è l’applicazione che al momento è più richiesta? E chi è il vostro cliente tipo?
Le applicazioni più richieste al momento sono l’analisi dell’esoma intero dell’uomo, cioè di tutte le regioni codificanti, ed il ChIP sequencing per identificazione di regioni bersaglio delle più comuni modificazioni istoniche ma anche per i fattori o cofattori di trascrizione. I nostri clienti sono generalmente ricercatori di ottimo livello internazionale, italiani o di istituzioni estere in tutti i settori biomedici di punta, oncologia, cardiologia, neuroscienze, oftalmologia, cellule staminali e medicina riproduttiva e rigenerativa.

Oltre ad offrire servizi, siete anche disponibili per collaborazioni scientifiche. Quali sono stati i progetti di ricerca più interessanti a cui avete partecipato?
I progetti a cui abbiamo collaborato sono tutti molto interessanti, alcuni sono in fase di conclusione e pubblicazione. In particolare abbiamo un progetto con l’Istituto Pasteur di Parigi sulla scoperta di meccanismi di infertilità nell’uomo, un progetto con l’INT per l’analisi del trascrittoma in cellule tumorali a partire da quantità molto ridotte di RNA. Inoltre abbiamo recentemente ottenuto un finanziamento dal Ministero della Salute per un progetto in collaborazione con l’IDI ed il Centro Cardiologico Monzino, in cui ci si prefigge di sviluppare una strategia di manipolazione dei microRNA volta ad aumentare le potenzialità rigenerativa delle cellule mesenchimali cardiache per il trattamento del miocardio infartuato, ed uno in collaborazione con Mysui, Università di Tor Vergata e Istituto di Neuroscienze del CNR sui meccanismi molecolari che rendono la restrizione calorica uno dei trattamenti anti-invecchiamento più potenti sino ad ora scoperti.

Molti ritengono che sia l’analisi bioinformatica dei dati il collo di bottiglia del sequenziamento di nuova generazione. Nel vostro caso qual è la difficoltà principale nelle vostre attività, la fase di lavoro che vi impegna per più tempo?
Certamente l’analisi bioinformatica è un processo impegnativo e che richiede molto tempo e spesso uno scambio costante di informazioni e di idee con i ricercatori coinvolti nell’esperimento, non è un lavoro “meccanico”, bisogna prevedere per l’analisi bioinformatica lo stesso tempo dedicato alla parte biologica. La costruzione delle librerie da sequenziare è ancora un processo che richiede molto tempo manuale e quindi abbastanza lungo, anche se si sta andando in direzione di un’automatizzazione necessaria per effettuare progetti su larga scala.

Leggendo il vostro organigramma sul sito di Genomnia, sembra che abbiate solo quattro persone che si occupano direttamente dell’attività di ricerca. Pensate di acquisire nuovo personale nei prossimi mesi o preferite restare una piccola realtà?
Siamo pochi, ma il livello dello staff è veramente eccellente! Sì, abbiamo in programma di assumere un tecnico di laboratorio ed un nuovo bioinformatico.

Quando fu sequenziato il genoma umano, molti si aspettavano che la medicina e la società in genere sarebbero state rivoluzionate da questa grande conquista della scienza. Invece, a distanza di dieci anni, le cure personalizzate sul proprio codice genetico non si sono ancora affermate. Qual è la ragione principale, secondo lei?
Il completamento del sequenziamento del genoma umano nel 2000 ha in effetti alimentato molte speranze sia in termini di medicina personalizzata, secondo la quale le terapie potessero essere “disegnate” sul paziente, che di crescita economica legata all’ipotetica crescita delle biotech che avrebbero potuto beneficiare di questa scoperta, ma ha anche suscitato moltissime preoccupazioni legate all’uso non etico che si sarebbe potuto fare delle informazioni codificate nel DNA. A tutto questo clamore è seguito un periodo di grande calma. Chi lavora in questo settore conosce l’importanza del progetto genoma umano, senza il quale non sarebbe possibile per migliaia di ricercatori studiare la complessità del genoma e dei meccansmi che regolano l’espressione dei geni, e capire che ciascun genoma è così diverso che bisogna studiarne tanti per poter associare, ad esempio, variazioni della sequenza dei geni alle malattie.

Recentemente, Steven Salzberg dell’Università del Maryland ha messo online un software open source di sua creazione che consente di analizzare il proprio genoma dal computer di casa, al fine di identificare varianti genetiche che possano predisporre ad alcune malattie, e tutto questo senza l’intervento di un medico. Lei cosa pensa della genetica fai-da-te?
E’ una domanda complessa, che comporta una serie di valutazioni che coinvolgono sia aspetti scientifici che etico-legali che sociologici. Non sono in linea di massima contraria alla possibilità che un consumatore possa richiedere di conoscere se sia portatore di variazioni genetiche collegate al rischio di sviluppare determinate patologie, e non sono contraria per varie ragioni, una è che bisognerebbe garantire la libertà di poter essere informati sul proprio stato di salute e le proprie prospettive future ed eventualmente poter scegliere stili di vita più adeguati alle proprie predisposizioni genetiche o intraprendere comportamenti, anche drastici, che possano ridurre le conseguenze di queste mutazioni (si pensi alle mutazioni del gene BRCA1 ed il rischio di cancro al seno e alla scelta di molte donne di sottoporsi addirittura alla mastectomia preventiva). Il problema è la qualità delle informazioni che vengono fornite e della scienza su cui poggiano, e di garantire un counseling successivo ai pazienti portatori di variazioni del codice cenetico potenzialmente fatali (si pensi alla Corea di Huntington).

In un sondaggio, ho chiesto ai lettori del blog quanto sarebbero disposti a spendere per sequenziare il proprio genoma. Secondo lei, con la conoscenza del DNA che abbiamo attualmente, quanto vale realmente un genoma sequenziato? Quanto può essere utile conoscere il proprio codice genetico?
Il tipo e l’utilità di informazioni che può fornirci un genoma intero oggi in termini diagnostici, pagando un prezzo nell’ordine delle decine di migliaia di euro, si possono ottenere utilizzando metodi più economici, come il sequenziamento dell’esoma, cioè delle regioni codificanti. C’è ancora una grande quantità di lavoro da effettuare per capire il significato di mutazioni in regioni non codificanti, ma con un ruolo importantissimo.

Ringraziando la dott.ssa Moles, vi ricordo che il mio blog è disponibile ad accogliere nuovi interventi da parte di aziende italiane. Se siete interessati, non dovete far altro che scrivermi una mail! Se deciderete di acquistare i servizi di Genomnia ricordatevi di citare myGenomiX: sarà uno stimolo per continuare a curare il blog con sempre maggiore impegno e dedizione.

 

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Sequenziato il genoma di Ozzy Osbourne

Qualche tempo fa pubblicai la notizia che Ozzy Osbourne, il leggendario cantante rock ex leader dei Black Sabbath, avrebbe avuto il proprio genoma sequenziato. Lo scopo, al confine tra abile azione di marketing e ricerca scientifica, era quello di scoprire quali geni prodigiosi potessero aver consentito a Ozzy di raggiungere la veneranda età di 61 anni dopo una vita di alcool e droghe. Lo scorso weekend, sul Sunday Times sono apparsi finalmente i risultati dell’analisi, i quali, pur essendo certamente interessanti, non danno nessuna risposta definitiva all’interrogativo di partenza.

Ozzy è un cantante rock, non uno scienziato, e quando gli è stato proposto di farsi sequenziare non ha nascosto le proprie perplessità. “L’unico genome di cui ho sentito parlare – avrebbe dichiarato – è la statua con la barba bianca e il cappello a punta che si mette in giardino. Per quanto riguarda i geni poi, conosco solo un Gene, ed è il bassista dei Kiss.” Ci è voluto un po’, ma alla fine il Padrino dell’Heavy Metal si è convinto e ha consegnato il proprio DNA alla scienza.

Il genoma di Ozzy è stato sequenziato dall’azienda americana Cofactor Genomics con un SOLiD 4 della Life Technologies, società che oltre ad aver finanziato in parte il progetto si è anche occupata dell’analisi preliminare dei dati. Una volta ottenute le sequenze grezze, queste sono state infatti caricate sui server della Penguin Computing, sui quali sono state quindi analizzate per essere mappate sul genoma umano di riferimento. A farlo è stato Matt Dyer della Life Technologies, che è riuscito a posizionare sul riferimento circa il 70% delle sequenze prodotte: un risultato discreto, considerando che il genoma di Ozzy era stato sequenziato con una copertura di 13X. Dopo 8-10 ore di calcolo in modalità cloud computing per il mappaggio, Dyer doveva ora identificare gli SNP e le piccole inserzioni e delezioni presenti nel codice. Una volta ottenute, queste informazioni sono state inviate alla Knome, l’azienda che ha terminato le analisi e stilato l’interpretazione finale.

Cosa si è scoperto quindi, dopo questa costosa corsa contro il tempo? E’ emerso che Ozzy Osbourne possiede delle varianti particolari nel gene TTN, legato alla sordità e al Parkinson, e nel gene CLTCL1, attivo nel cervello. Il DNA ha inoltre confermato la sua sensibilità alla caffeina e ha suggerito una possibile spiegazione per la sua elevata tolleranza all’alcool: la variante responsabile potrebbe essere quella trovata nel gene dell’alcool deidrogenasi ADH4. Infine, il cantante porta nel suo codice genetico due varianti alleliche del gene COMT: la prima dovrebbe conferire capacità organizzative, pianificazione e capacità di autoregolarsi (è chiamata la variante “guerriera”); la seconda, invece, è associata a caratteristiche opposte (variante “ansiosa”). Come lo stesso Ozzy ha ammesso, queste due componenti sono entrambe presenti nella personalità della rock star e se la variante guerriera è quella che l’ha reso famoso, forse quella ansiosa lo ha tenuto in vita.

Piccola curiosità, Ozzy ha nel cromosoma 10 un paio di segmenti che arrivano dritti dritti dall’uomo di Neanderthal: da quando su Science è apparsa l’ipotesi che Sapiens e Neanderthal potrebbero essersi accopiati nel lontano Pleistocene, tutte le successive analisi di genomi hanno contemplato anche la ricerca di questa particolare eredità. Non preoccupatevi comunque: Ozzy Osbourne è un Homo sapiens a tutti gli effetti, e a giudicare dal suo genoma il genetista George Church è tre volte più Neanderthal di lui.

Non sappiamo ancora come Ozzy Osbourne sia riuscito ad arrivare alla sua età dopo una vita così sregolata, ma sicuramente questa iniziativa ha permesso alle aziende coinvolte (e alla genomica in genere) di farsi un po’ di pubblicità anche presso il grande pubblico. Molte varianti nel genoma di Ozzy erano già note, ma altrettante sono quelle mai viste prima d’ora dagli scienziati: il problema, però, è che non è possibile trarre delle conclusioni partendo da un singolo genoma. La ricerca di associazioni tra DNA e tratti fenotipici esige gruppi numerosissimi di persone, il cui codice genetico viene studiato e correlato con il loro aspetto fisico o le loro malattie.

Insomma, la scienza non ha imparato nulla dal genoma di Ozzy Osbourne, si possono soltanto fare supposizioni e ipotesi che devono essere validate con grandi popolazioni. Tuttavia, nella settimana in cui Nature pubblica i primi risultati del Progetto 1000 Genomi (questo sì che ha valenza scientifica), è il DNA del cantante britannico a interessare maggiormente la gente comune, e far avvicinare le persone alla genetica è anch’esso – secondo me – uno scopo nobile: quando il sequenziamento dei genomi entrerà nella nostra vita di tutti i giorni, è bene che tutti sappiano che cosa significa.

Fonti: Sunday Times, Bio-It World, Scientific American, Cofactor Genomics

 
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Pubblicato da su 29 ottobre 2010 in Genetica personale, Medicina, Salute, Tecnologia, Varie

 

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Life Technologies e Ion Torrent, un affare da 700 milioni di dollari

La Life Technologies è una delle aziende leader nel sequenziamento del DNA. Nata dalla fusione di Applied Biosystems e Invitrogen, la società di Gregory Lucier oggi dà lavoro a circa 9000 persone ed è presente in 160 nazioni: il suo sequenziatore di punta, il SOLiD, è una delle macchine più acquistate dai laboratori di mezzo mondo. Perché un colosso del genere dovrebbe investire più di 700 milioni di dollari in una piccola company del Connecticut? Perché la company in questione si chiama Ion Torrent, e la tecnologia messa a punto da questa giovane azienda promette di rivoluzionare il settore dell’high-throughput sequencing.

Sul proprio sito ufficiale, la Life Technologies ha infatti da poco annunciato di aver acquisito la Ion Torrent per la considerevole cifra di 375 milioni di dollari, a cui si aggiungeranno altri 350 milioni al raggiungimento di determinati obiettivi tecnici. Jonathan Rothberg, fondatore della Ion Torrent, non è nuovo ad affari di questa portata: nel 2007 vendette alla Roche la sua precedente azienda di sequenziamento (454 Life Sciences) per 140 milioni di dollari. La nuova tecnologia che ha ingolosito la Life Technologies si differenzia in modo drastico dai sequenziatori di seconda generazione: grazie a un materiale semiconduttore, le macchine della Ion Torrent sono in grado di leggere le sequenze di DNA misurando le variazioni di pH che si generano quando un nuovo nucleotide viene aggiunto al filamento sintetizzato. Niente più nucleotidi marcati, quindi, né costosi sistemi di rilevazione ottica.

Il primo sequenziatore della Life Technologies che utilizzerà questa rivoluzionaria tecnica di sequenziamento sarà la Personal Genome Machine (PGM) che verrà messa in vendita già da quest’anno per un prezzo attorno ai 100mila dollari. Il mercato del sequenziamento è dunque entrato davvero nella sua terza fase preannunciata al meeting AGBT di febbraio, e i protagonisti di questa nuova era saranno probabilmente i soliti: il matrimonio tra Life Technologies e Ion Torrent si va infatti ad aggiungere a un’altra collaborazione importante, quella tra Illumina e Oxford Nanopore. Come la Ion Torrent, anche la Oxford Nanopore sta infatti perfezionando una tecnologia innovativa che troveremo nei sequenziatori di terza generazione, e che nel caso specifico non utilizza più la DNA polimerasi.

 
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Pubblicato da su 18 agosto 2010 in Business, Tecnologia

 

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Next-next-generation sequencing: i nuovi protagonisti

dna-sequencing

David Munroe e Timothy Harris hanno pubblicato sull’ultimo numero di Nature Biotechnology un interessante articolo sulle nuove tecnologie di sequenziamento presentate al meeting Advances in Genome Biology and Technology (AGBT), tenutosi a Marco Island (Florida) dal 24 al 27 Febbraio scorsi.

Illumina e Life Technologies stanno lavorando duramente sulle loro macchine più recenti (HiSeq 2000 e SOLiD 4) e promettono di arrivare entro la fine dell’anno a livelli di throughput straordinari, oltre che a una maggiore automatizzazione nella preparazione dei campioni. Nel 2009, a queste due grandi aziende si è aggiunta la Complete Genomics, che ha sviluppato un sistema proprietario piuttosto complesso basato sulla ligazione e che ha scelto un modello di business differente, puntando sul servizio di sequenziamento piuttosto che sulla vendita delle macchine.

Benché eccellenti, queste piattaforme si basano comunque su tecnologie di seconda generazione. Molto più entusiasmo hanno suscitato all’AGBT le aziende definite di terza generazione, che stanno inventandosi nuove strategie di sequenziamento caratterizzate da templati a singola molecola. Queste tecniche potranno vantare costi e tempi ridotti, oltre a una preparazione dei campioni e un’analisi dati semplificate. Usare una singola molecola di DNA come templato ridurrà la quantità di materiale necessario, mentre i tempi di sequenziamento ridotti (minuti e non più giorni) potrà consentire l’utilizzo di queste tecnologie nella diagnostica di routine.

Le principali protagoniste di questa nuova fase sono Pacific Biosciences, Life Technologies, Oxford Nanopore e Ion Torrent. Le prime due utilizzano DNA polimerasi e nucleotidi marcati, e producono reads molto lunghe (1000-1500 basi) in tempi brevi (15-20 minuti per corsa). Inoltre, entrambe le aziende hanno sviluppato un sistema che consente alla polimerasi di non venire danneggiata dalla continua stimolazione luminosa del laser di eccitazione, come invece accade per le tecnologie di seconda generazione.

Oxford Nanopore e Ion Torrent sono più innovative, ma più lontane dal lancio commerciale dei loro strumenti. Nel primo caso il sequenziamento avviene ad opera di una esonucleasi che stacca dalla molecola di DNA una singola base, la quale entrando in un nanoporo va a disturbare la corrente elettrica che lo attraversa in un modo caratteristico della specifica base azotata. La Ion Torrent utilizza ancora la DNA polimerasi, ma invece di un segnale luminoso va a misurare gli ioni idrogeno rilasciati durante la reazione di elongazione della molecola di DNA. Nessuna delle due tecnologie fa uso di nucleotidi marcati e di costosi sistemi di rilevazione ottica, il che le rende molto più economiche.

Ci troviamo in un’epoca splendida per la genomica. Numerose società stanno investendo risorse ingenti per produrre sequenziatori sempre più potenti e sempre meno costosi: tutto lascia pensare che presto l’analisi del DNA entrerà a far parte della nostra vita di tutti i giorni.

Munroe DJ et al “Third-generation sequencing fireworks at Marco Island” Nature Biotechnology 2010, 28(5): 426-428

 
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Pubblicato da su 20 maggio 2010 in Business, Tecnologia

 

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SOLiD e GAII, insieme è meglio

Il lavoro è stato pubblicato nel 2009, ma non se ne è accorto quasi nessuno. Il motivo? Gli autori (un gruppo di ricercatori russi) hanno scelto di pubblicarlo su Acta naturae, una nuova rivista russa semisconosciuta e nemmeno indicizzata in Pubmed. Probabilmente hanno avuto le loro ragioni per farlo: essendo stati i primi russi a sequenziare un genoma umano, avranno voluto dare al lavoro una connotazione nazionalistica. Finalmente, dopo mesi, qualcuno ne ha parlato, e così sono andato a dare un’occhiata all’articolo.

Skryabin e colleghi hanno sequenziato il genoma di un russo adottando due tra le tecnologie next-generation più utilizzate: il SOLiD della Applied Biosystems e il Genome Analyzer II della Illumina. Benché ormai non ci sia più niente di così speciale nel sequenziare un genoma umano, gli autori riescono a rendere interessante il proprio lavoro facendo un’attenta analisi comparativa dei risultati ottenuti con l’una o l’altra tecnologia.

Il primo risultato interessante che emerge è questo grafico, dove sono rappresentate le distribuzioni relative al livello di coverage del genoma umano di riferimento con il SOLiD e il GAII, e le differenze sono notevoli. La tecnologia della Applied riesce a coprire in modo estremamente uniforme il genoma di riferimento, mentre quella della Illumina sembra preferire certe zone piuttosto che altre: in alcuni tratti si raggiungono coverage di 40-50X! L’alta copertura di questi tratti va però a discapito di tanti buchi in altre regioni, e infatti benché le sequenze prodotte dal GAII siano molto di più di quelle prodotte dal SOLiD, quest’ultima tecnologia riesce a coprire il 95% del genoma di riferimento, contro un modesto 75% della macchina Illumina.

Coverage depth

Il Genome Analyzer II si prende la sua rivincita nella capacità di individuare SNPs, ossia variazioni rispetto alla sequenza di riferimento: il SOLiD ne trova molti di meno. Tuttavia, non tutti gli SNPs rilevati dal SOLiD sono visti anche dal GAII, di conseguenza unendo i risultati delle due tecnologie si ottengono molte più informazioni che prendendole singolarmente.

Questo lavoro dimostra che i due metodi di sequenziamento sono complementari tra loro, e un loro utilizzo integrato potrebbe essere la strategia migliore per ottenere coverage elevati e uniformemente distribuiti.

Skryabin et al. “Combining two technologies for full genome sequencing of human” Acta Naturae 2009, 3

 
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Pubblicato da su 17 maggio 2010 in Tecnologia

 

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